UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS
ARMADAS
CARRERA DE INGENIERÍA EN
BIOTECNOLOGÍA
PERFIL DEL PROYECTO INTEGRADOR
III-A
Nivel: SÉPTIMO
“Caracterización molecular de bacterias del género Rhizobium de plantas de Chocho silvestre (Lupinus mutabilis S.) en Sangolquí - Ecuador.”
GRUPO DEL PROYECTO
Oviedo Alejandra
SANGOLQUÍ - MARZO DEL 2013.
Índice
Contenido
Caracterización molecular de
bacterias del género Rhizobium de
plantas de Chocho silvestre (Lupinus
mutabilis) en Sangolquí – Ecuador.
Las
bacterias del género Rhizobium son
microorganismos especializados en realizar simbiosis con plantas de leguminosas
cumpliendo la función de fijar nitrógeno del suelo para ser incorporado al
proceso de germinación y desarrollo de plantas (Cruz, 2010).
La
fijación en simbiosis resulta eficiente calculándose que sólo la asociación rhizobia – leguminosa puede llegar a
aportar más de 300 kilogramos por hectárea y año. Por ello, determinados
cultivos de leguminosas no requieren fertilización que puede ser aprovechado
por cultivos asociados o por las plantaciones posteriores en una rotación de
cultivos (Díaz, 2010).
Es
posible utilizar fertilizantes comerciales del mercado, pero hay un
inconveniente debido a que estos poseen cepas de rhizobium que no son nativas
del Ecuador y por ende no realizan la simbiosis y fijación de nitrógeno
esperada en el campo, es de donde parte la idea de estudiar las cepas nativas
ecuatorianas para su posterior aplicación en campo (Carpio, 2014)
Razón
por la que la caracterización molecular de cepas nativas de bacterias del
género Rhizobium en plantas de Chocho silvestre (Lupinus mutabilis) permite un estudio
sobre las especies nativas presentes en el país y resulta de importancia para el banco de cepas ecuatorianas del INIAP.
Bacterias
del género Rhizobium que forman
nódulos en plantas de Chocho silvestre (Lupinus
mutabilis S.).
Investigación
taxonómica, Biología Molecular, Biotecnología Vegetal, Biotecnología Industrial.
General
Caracterizar molecularmente
bacterias del género Rhizobium de
plantas de Chocho silvestre (Lupinus
mutabilis S.) en Sangolquí – Ecuador.
Específicos
- Identificar
a nivel de especie mediante Microbiología Tradicional un cultivo puro de
bacterias del género Rhizobium
provenientes de Chocho silvestre (Lupinus mutabilis S.).
- Caracterizar
las bacterias del género Rhizobium
a nivel de especie mediante técnicas de Biología Molecular.
§
Comparar
los resultados obtenidos con la base de datos NCBI para la confirmación de
especie nativa.
Es posible caracterizar molecularmente bacterias del género Rhizobium de plantas de Chocho silvestre (Lupinus mutabilis S.) y comparar los
resultados con el NCBI para confirmar especies nativas en Sangolquí – Ecuador.
A partir
de una cepa previamente aislada y purificada se utilizarán medios selectivos
para el crecimiento de especies de Rhizobium
como TY (Yeast - Triptona) y YMA (Yeast- Manitol Agar) con vitaminas y
sales al 1 %.
Tabla 1. Yeast Triptona (Levadura
Triptona, medio completo para Rhizobium)
Componente
|
g.L-1
|
Triptona
|
5.0
|
Extracto de levadura
|
3.0
|
CaCl2
|
1.0
|
Agar
|
10.0
|
(Díaz, 2010).
Este medio de cultivo se suplementa con antibióticos:
Tabla 2. Antibióticos adicionados al medio TY.
Antibiótico
|
Solución madre mg/mL
|
Disolvente
|
Concentración final µg/mL
|
Estreptomicina
|
200
|
H2O
|
200
|
Tetraciclina
|
10
|
H2O
|
10
|
(Díaz, 2010).
Tabla 3.
Identificación de especies de Rhizobium
mediante medios selectivos.
Medio
|
R. leguminosarum
|
R. etili
|
R. galegae
|
R. gallicum
|
R. giardinii
|
R. hainanense
|
R. huautlense
|
R. mongolense
|
R. tropicali
|
Biotina
|
d
|
-
|
-
|
+
|
N
|
N
|
N
|
N
|
N
|
Pantotenato
|
+
|
-
|
+
|
N
|
N
|
N
|
-
|
N
|
N
|
Tiamina
|
d
|
-
|
-
|
N
|
N
|
N
|
+
|
N
|
N
|
Rango de pH.
|
4-9
|
N
|
5-9,5
|
4-8
|
4-8,5
|
5-10
|
5-9
|
4-10
|
4-10
|
Crecimiento a 40 C.
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
N
|
+
|
YMA con 1% NaCl
|
-
|
N
|
d
|
-
|
d
|
+
|
+
|
-
|
-
|
YMA con 2% NaCl
|
-
|
N
|
-
|
-
|
-
|
+
|
-
|
-
|
-
|
(biblioweb.tic.unam, S/A).
Además se
realizarán pruebas bioquímicas que permitirán comprobar si las bacterias
obtenidas son del género Rhizobium.
Se aislará
cepas puras de Rhizobium y se
conservará en caldo YM (Yeast – Manitol Agar) con rojo fenol y en medio TY
(Yeast -Triptona), añadiéndole aceite mineral y conservándolo bajo
refrigeración a - 80°C para su conservación (Koch, 2012).
Para extraer el DNA las cepas se inocularan en placas
con medio TY y se incuban durante 24-48h a 28ºC. A continuación se resuspenden
las células en 200μL de agua estéril. Se
centrifuga durante 15s a 10000 rpm. Las células se resuspenden en 200μL de sarcosyl al 1%, se centrifuga a 14000 rpm durante 4min y se desechó
el sobrenadante (Díaz, 2010)
La extracción del DNA se lleva a cabo añadiendo a las
células 100μL de NaOH 0.05M, que se calentaron a 100ºC durante 4
min. Transcurrido este tiempo se añaden 300μL de agua miliQ estéril, se homogeneiza la mezcla de forma suave y se
centrifuga a12000 rpm durante 3min para eliminar los restos celulares. Después
de la centrifugación, se trasvasa el sobrenadante a un segundo tubo Eppendorf
de 1.5 mL, se añade un volumen igual de fenol/cloroformo/isoamílico (25:24:1),
se homogeneiza con micropipeta durante 10s y se centrifuga a 12000 rpm durante
3min (Díaz, 2010).
La fase acuosa se trasvasa a un tubo nuevo y se
adiciona un volumen equivalente de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se
homogeneiza nuevamente durante 10s y se centrifuga durante 3min a 12000 rpm. Se
trasvasa una vez más la fase acuosa a un nuevo tubo, se añaden 0.07 volúmenes
de acetato de sodio pH 7 (Amresco, USA) y 4 volúmenes de etanol absoluto. Se
agita por inmersión y se mantuvo a -20ºC durante 12h. Las muestras se
centrifugan a 12000 rpm durante 20min, se elimina el sobrenadante y las
muestras se secan durante 5min. Se agregan 200μL de agua miliQ estéril a cada uno de los tubos y se calentan a 42ºC
durante 15 min para disolver el DNA (Díaz, 2010).
Posterior a la extracción se procede a hacer una
corrida electroforética con los primers específicos ADNr 16S como se muestra a
continuación
Tabla 4: Secuencia de los cebadores usados para 16S rDNA
(Rivas et al; 2001 citado por Díaz, 2010).
Se
tomarán las secuencias obtenidas posterior a la PCR y se utilizará una búsqueda
avanzada en la base de datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information),
las especies descritas y su apareamiento con los primers dispuestos se analizarán
mediante el programa bioinformático BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
(Peña, 2013).
Además
se comparara con la base de datos sobre las especies formadoras de nódulos en
Chocho Silvestre (Lupinus mutabilis S.).
El nitrógeno es uno de los elementos químicos esenciales para todos los
seres vivos, debido a que forma parte de los ácidos nucleicos y de las
proteínas. Las plantas toman el nitrógeno directamente desde el suelo en forma
de nitratos (NO3-) o amonio (NH4+)
y solo algunos procariotas pueden asimilar el nitrógeno de forma libre,
convirtiendo el nitrógeno molecular en nitrógeno asimilable por otros seres
vivos (Díaz César., 2010).
La obtención de nitrógeno directamente desde la atmósfera es una de las vías más
importantes para el mantenimiento del ciclo del nitrógeno, del que forman parte
las bacterias fijadoras de nitrógeno, junto con otros grupos de bacterias que
llevan a cabo procesos intermedios de transformación de compuestos nitrogenados
y de desnitrificación, que devuelve finalmente el nitrógeno a la atmósfera (Díaz César,
2010).
Bacterias
fijadoras de Nitrógeno
La
fijación biológica de nitrógeno se encuentra dada por microorganismos que se
denominan diazotrofos, la fijación se halla mediada por la enzima nitrogenasa
que está compuesta por dos metaloproteínas
de las cuales una posee Fe (ferroproteína o nitrogenasa reductasa) y
otra con Fe y Mo (ferromolibdoproteína o nitrogenasa propiamente dicha). La
leghemoglobina es un pigmento similar a la hemoglobina de los seres humanos,
que cumple con la función de proteger a la enzima nitrogenasa, la cual se es
afectada por procesos de oxidación (Soto & Baca, 2001).
Figura
1. Simbiosis entre una leguminosa (Phaseolus
vulgaris L.) y Rizhobium (Díaz César, 2010).
Figura 2. Corte de un nódulo de Rhizobium, donde se evidencia el pigmento leg-hemoglobina en la
zona de bacteroides (biología, S/A).
Son
bacterias Gram negativas, heterótrofas (saprófitas) de pequeño tamaño y capaz
de producir nódulos sobre las raíces de leguminosas o vivir de forma libre. En
simbiosis, son alfa-protobacterias
(capaces de cambiar de forma), utilizan variadas fuentes de carbono, forman
capas de mucílago; mientras que en vida libre tienen una tasa respiratoria
elevada, forman cistos, pueden vivir en suelos alcalinos, tienen poca eficacia
de fijación de nitrógeno pero tienen una amplia distribución (Sanchéz, 2011).
Son
aerobias y su temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre 25 y 30°C
(Gómez, 2005).
Caracterización
Molecular de bacterias del género Rhizobium
Para
el estudio de uso de las especies de Rhizobium
las técnicas moleculares ha provisto de una descripción más precisa. El
análisis de secuencia de los genes 16S rRNA se ha convertido en uno de los
principales criterios para la clasificación de géneros y especies (Wang, et al., S/A).
Se
considera que las cepas cuyas secuencias del gen 16S rRNA son similares en un
97% o más, probablemente pertenecen a la misma especie. Las relaciones
filogenéticas inferidas del parecido de las secuencias de genes de 16S rRNA
también constituyen la base principal para la descripción de los diferentes
géneros de rhizobios; sin embargo, no hay un porcentaje definido para marcar
las fronteras entre géneros (Wang, et
al., S/A).
Chocho silvestre (Lupinus
mutabilis S.)
Figura 3. Planta
de Chocho silvestre (Lupinus mutabilis S.)
(soziologie, S/A).
El chocho silvestre es originario de la zona Andina de Sudamérica y se
considera como la única especie del género
Lupinus domesticada y cultivada como leguminosa, seguido de cereales y
otros cultivos es el sistema más importante en Chimborazo, Cotopaxi y
Pichincha; la superficie cultivada en Ecuador supera las 70 000 ha/año, de las
cuales alrededor del 90% se hallan ubicadas en la región Sierra (Jacobsen y
Sherwood, 2002, citado por Carpio, 2014).
El chocho silvestre se caracteriza por ser altamente eficiente en la
fijación biológica de nitrógeno, ya que sus cepas nativas se han adaptado a las
condiciones del suelo y para esto no es necesario aplicar fertilizantes
químicos, permitiendo así un manejo y conservación del suelo (Peralta y
Caicedo, 2001, citado por Carpio, 2014).
Se ha descrito nodulación de algunas especies de Lupinus por parte de bacterias de la familia Bradyrhizobiaceae, Brucelaceae y Phyllobacteriaceae; y cada planta
puede llegar a producir hasta 50 nódulos (Peralta y Caicedo, 2001, citado por
Carpio, 2014).
Se identificará a nivel de especie mediante biología molecular de chocho
silvestre (Lupinus mutabilis),
obteniéndose una especie nativa de Sangolquí- Ecuador.
Localización:
El presente proyecto se
realizará en los laboratorios de Docencia y Microbiología Molecular del Área de
Microbiología perteneciente a la Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE,
campus Sangolqui.
Humana: Se contará con el apoyo de la Msc. Alma Koch
encargada de los laboratorios de Microbiología de la Universidad de las Fuerzas
Armadas – ESPE, campus Sangolqui como Cotutora del proyecto y guía de la parte
microbiológica, seguido de la guía del PhD Jeffar Gooty, Prometeo de la India y
profesor de la Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, campus Sangolqui en
la parte de biología molecular.
Cabe recalcar el apoyo por parte del Ingeniero Marco Taipe como Tutor del
proyecto y guía para la parte estadística.
Financiera:
El proyecto será
financiado por parte del grupo de Investigación de la Universidad de las
Fuerzas Armadas – ESPE, en convenio con el INIAP y Senecyt. En la tabla 5 se
detalla la parte financiera del Proyecto:
Tabla 5. Detalle de costos en dólares sobre el proyecto, sin incluir el
costo de equipos los cuales son aportados por los laboratorios de la
Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE.
DETALLE
|
COSTO en Dólares
|
Primers Forward
and Reverse, con kit de
Extracción de
ADN
|
$ 350,00
|
Medios de
cultivo
|
$ 30,00
|
Instrumentación
y vidriería
|
$ 35, 00
|
Materiales y
otros insumos
|
$ 20, 00
|
TOTAL
|
$ 435, 00
|
11.
Cronograma
- - Biología. (S/A). Imagen
nódulo de Rhizobium. Recuperado el 15 de junio del 2014 de: http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema20/images20/nodule_structure.jpg
- -
Carpio, M. J. (2014). Caracterización morfológica y bioquímica de
cepas de Rizobios asociados a cultivos de arveja (Pisum sativum L.), Chocho
(Lupinus mutabilis S.), Fréjol (Phaseolus vulgaris L.), Haba (Vicia faba L.) y
Vicia (Vicia sp.) en suelos de la provincia de Imbabura y obtención de un banco
de cepas. Memoria para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología,
Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE, Sangolqui, Ecuador.
- -
Díaz, C. G. (2010). Aislamiento,
caracterización y selección de rhizobia autóctonos
que nodulan habichuela roja (Phaseolus
vulgaris L.) en la Republica Dominicana.
Tesis Doctoral. Universidad de León. Republica Dominicana.
- -
Koch, A. (2012). Manual de Laboratorio de
Microbiología. Universidad de las Fuerza Armadas. Carrera de
Ingeniería en Biotecnología. Quito.
- -
Peña C. (2013). Uso de BLAST
y búsqueda de secuencias en NCBI. Universidad de las Fuerzas Armadas.
Bioinformática. Quito.
- -
Soto, L., Baca, B. (2001). Mecanismos
de Protección de la Nitrogenasa a la Inactivación por Oxígeno. Revista
Internacional de Microbiología. México.
- -
Soziologie (S/A). Imagen chocho silvestre. Recuperado el 15 de junio del 2014 de: http://www.soziologie-etc.com/med/heilung-o-medi/Chirre-ESP/Chirre_medicina-natural-d/tarwi--chocho--Lupinus-mutabilis.jpg
